限制酶作用于DNA分子的氢键，限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。
一般情况下，所有酶都能重复使用，因为酶是化学反应的催化剂，不参与反应，不会被消耗。限制酶是酶的一种，不会参与化学反应，不会被消耗，可重复使用。
每种限制酶可特异识别专一DNA序列，并在切割位点将其准确切割。细菌将自身的DNA甲基化修饰，防止了被自身核酸内切酶降解。这些甲基化基团被装到DNA大沟的腺嘌呤或胞嘧啶上，使限制酶不能与DNA序列结合，但又不影响这些DNA序列上遗传信息的正常识别与表达。
基因工程中的构建基因表达载体需用到限制酶和DNA连接酶，限制酶会识别限制酶切割位点(即某个DNA序列，如AACC--TTGG，当然，不同的限制酶作用位点不一)，限制酶能将磷酸二酯键切断，不是随便切断，而是特定的。
限制酶不只存在于原核生物中，一方面是因为现在的生物技术限制，我们只在原核生物中发现了限制酶，但不能武断的说限制酶内仅存在于原核生物中，我们甚至可以肯定的说在高等生物中一定存在限制酶，另一方面现在的限制酶已经可以人工合成了。
限制酶在原核生物中的作用百是防止外来病原物的侵害，将外源DNA切割保证自度身安全。它能识别DNA分子的某种特定核知苷酸道序列，并切割两个核苷酸之间的磷酸二酯回键，产生的末端有黏性末端（如EcoRⅠ切割的末端）和答平末端。
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